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新生牛血清白蛋白的提取

2017-09-05 瀏覽次數(shù):1562

  新生牛血清白蛋白(BSA),又稱第五組分,是牛血清中的一種球蛋白,包含583個(gè)氨基酸殘基,分子量為66.430 kDa,等電點(diǎn)為4.7。新生牛血清白蛋白在生化實(shí)驗(yàn)中有廣泛的應(yīng)用,例如在western blot中作為Blocking agent。

新生牛血清


    新生牛血清白蛋白的提取大致可以分為5步。
  1、鹽析:
  取離心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)稀釋血清,搖勻后,逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液2mL,邊加邊搖,充分混勻,然后靜止放臵10分鐘,再離心(4000r/min)10min,將上清液傾入試管中。
  2、透析:
  取玻璃紙一張,折成袋形,將離心后的上清液倒入袋內(nèi),用線扎緊上口(注意要留有空隙),用玻璃棒懸在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯內(nèi),使透析袋下半部侵入水中,對蛋白液進(jìn)行透析,常用玻璃棒攪拌袋外(燒杯中)液體,以縮短透析時(shí)間。更換蒸餾水多次,用納氏試劑檢查袋外液體的NH4+,觀察顏色變化,直至袋內(nèi)鹽
  分透析完畢。將袋內(nèi)液體傾入試管,即得牛血清白蛋白溶液。
  3、電泳:
    1)點(diǎn)樣 取一張膜條,將薄膜無光澤面向下,放入培養(yǎng)皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透,取出,用干凈濾紙吸去多余的緩沖液,以薄膜的無光澤面距一端1.5㎝處作點(diǎn)樣線,將牛血清樣品與待測的牛血清白蛋白溶液分別用點(diǎn)樣器在同一張薄膜的點(diǎn)樣線處不同位臵點(diǎn)樣。
    2)電泳 將點(diǎn)樣后的膜條臵于電泳槽架上,放臵時(shí)膜條無光澤面向下,點(diǎn)樣端臵于陰極,待平衡5min后,打開電源,調(diào)節(jié)電泳儀的電壓為160伏,通電60min,關(guān)閉電源后用鑷子將膜條取出。
    3)染色 將膜條直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中,染2分鐘取出,立即浸于漂洗液中,分別在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min,直至背景漂洗干凈為止,用濾紙吸干薄膜。
    4)鑒定 比較樣品與待測液中白蛋白在薄膜上的電泳結(jié)果,看位臵是否一致。
  4、 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑:
  儀器:離心管、離心機(jī)、試管、玻璃紙、燒杯、比色磁盤、滴管、玻璃棒、電泳儀、醋酸纖維素薄膜、分光光度計(jì)。
  試劑:牛血清待測液、牛血清樣品、PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水,用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)配制的0.9%NaCl溶液)、pH7.2飽和硫酸銨溶液、納氏試劑、巴比妥緩沖液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氫氧化鈉溶液。
  5、預(yù)測結(jié)果:
  位臵一致,實(shí)驗(yàn)成功。若在待測液的電泳結(jié)果中出現(xiàn)其他球蛋白的黑帶區(qū)域,則說明提取不夠純。

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