細胞培養(yǎng)、細胞凍存注意事項

一、怎樣凍存動物細胞?

一個實驗室得到一個新的細胞株后，首先要把該細胞株培養(yǎng)擴增后凍存起來。細胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細胞時有備份可用，另外幾乎所有細胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實驗結果的一致，一般細胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細胞化凍培養(yǎng)再使用。

細胞冷凍過程有四個要點：細胞的收獲、保護劑的使用、冷凍速率和儲存環(huán)境。

(1) 細胞的收獲

用來凍存的細胞一般選擇在細胞約鋪滿 90% 的時候，這時細胞生長狀態(tài)好，細胞數(shù)量也多，并且在收獲細胞前 24 小時換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存的細胞開始時方法和平時一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細胞再重懸，活細胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細胞保存的最終細胞濃度的二倍(一般是 400-1000 萬 細胞 /ml )，加入已經配好的等體積的培養(yǎng)液保護劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。

(2) 保護劑的使用

細胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護劑。在細胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細胞特別是雜交瘤細胞在凍存時使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會好些。保護劑在使用時先用培養(yǎng)液或血清配成最終濃度的2倍，再與等體積的懸浮細胞的培養(yǎng)液混合。

(3) 細胞凍存的速率

細胞的冷凍速率最適控制在讓細胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導致細胞損害。對大多數(shù)細胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。通常的操作是把細胞先在-20℃1-2個小時，再放入 -80℃冰箱過夜(如果沒有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再轉入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長期保存。

(4) 儲存環(huán)境

細胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因為這樣可避免由于有液氮進入凍存管而在拿出細胞時引起爆炸(但是這樣液氮罐內只能存儲少量液氮，需要經常添加)。細胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。

二、怎樣化凍動物細胞?

● 化凍過程的原則是要讓凍存的細胞快速融化。

● 如果細胞儲存在液氮液面下，使用者最好準備好必要的防護器具(至少要戴上護目鏡，最好戴上面罩和較厚的手套)，防止進入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害。從冰箱或液氮罐取出細胞后將凍存管放37℃水浴輕輕晃動使之化凍*，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發(fā)生。

● 由于大多防凍劑與細胞長時間接觸時對細胞有毒害，所以最好盡快除去細胞凍存時加入的防凍劑。

● 防凍劑的去除方式和細胞的敏感性有關。有些細胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長，可以直接將化凍的凍存細胞連同其凍存液加入預備好15-20ml

培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后換培養(yǎng)液。

● 對于敏感細胞要加入 10ml 培養(yǎng)液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養(yǎng)液輕輕重懸細胞，加入培養(yǎng)器皿后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第二天更換培養(yǎng)液。