大/小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法（一）

二十世紀(jì)七十年代，F(xiàn)riedenstein從骨髓中分離出一種多能基質(zhì)細(xì)胞，呈梭形，可以進(jìn)行體外克隆和多向分化，被稱為CFU－Fs(colony－formingunitfibro-blasts)。隨后，這種骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞被進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)是間葉組織細(xì)胞譜系的共同前體細(xì)胞，因其具有干細(xì)胞的部分特性，而被命名為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。

BMSCs來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，免疫原性低。但是不同的分離培養(yǎng)方法使得BMSCs在體外擴(kuò)增時(shí)的純度、活性、表型和分化潛能差異很大，導(dǎo)致基礎(chǔ)研究結(jié)論各異和臨床試驗(yàn)效果不一。因此，深入認(rèn)識(shí)BMSCs不同分離方法和培養(yǎng)條件的優(yōu)缺點(diǎn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖龀鱿鄳?yīng)選擇，是進(jìn)行BMSCs實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

01  貼壁篩選法

貼壁篩選法是利用細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁牢固性的不同，逐步將非貼壁細(xì)胞和其它雜質(zhì)細(xì)胞去除的一種簡單易行的方法，常用于干細(xì)胞的培養(yǎng)中，因此用于分離BMSCs最為廣泛。

利用BMSCs貼壁生長特性，更換培養(yǎng)液逐步去除漂浮生長的造血系統(tǒng)細(xì)胞即可獲得較純化的BMSCs；而且骨髓中的造血干細(xì)胞能分泌生長因子和促貼壁物質(zhì),可促進(jìn)BMSCs貼壁生長，貼壁篩選法也常被稱為直接培養(yǎng)法或者全骨髓法。

操作步驟

01  以頸椎脫臼法處死SPF級(jí)3-4周齡C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar大鼠，用75%乙醇浸泡。

02  隨后在鼠的腿的位置剪開外皮和內(nèi)皮，無菌狀態(tài)下取出雙側(cè)股骨和脛骨，浸泡于無菌含雙抗PBS溶液中。剔除股骨和脛骨周圍的肌肉、結(jié)締組織（圖1-1），用含雙抗的PBS溶液清洗三遍。

03  用眼科剪剪去股骨和脛骨的兩端，暴露骨髓腔（圖1-2）。

04  用注射器以*培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔直至骨頭發(fā)白（圖1-3）。

05  收集骨髓液（圖1-4），離心（圖1-5），后加入適當(dāng)培養(yǎng)基（含20%血清）（圖1-6）接種于培養(yǎng)基皿（圖1-7）中置于37℃，5％ CO2，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（圖1-8）。

06  24-48h后去懸浮，接下來的每3天換液一次，直到需要傳代。

圖1 貼壁篩選法分離提取BMSCs

對(duì)初次培養(yǎng)者來說，貼壁法分離BMSCs操作簡單易掌握，不易發(fā)生污染，是一個(gè)較好的分離方法。不足的是分離提取的細(xì)胞純度相對(duì)不高。

02  骨組織消化法

骨組織消化法操作簡單、成本低，且獲得的BMSCs純度較貼壁篩選法高，是分離BMSCs較為常用的方法。

操作步驟

01  參照貼壁篩選法上述操作步驟第1-3步，收集沖去骨髓的股/脛骨于無菌的培養(yǎng)皿中，用無菌眼科剪小心地將骨組織剪成約1～3mm3的碎片。

02  之后加入適量含1mg/mL Ⅱ型膠原酶的新鮮*培養(yǎng)基（含5% FBS），于37℃搖床中振蕩消化 。

03  消化結(jié)束后離心，棄上清液，用PBS清洗兩次，然后將骨碎片接種于培養(yǎng)皿中，加入適量新鮮的*培養(yǎng)基（含20% FBS）淹沒骨碎片，并置于37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

04  培養(yǎng)至72h后進(jìn)行半量換液。此后每3天換一次液。待貼壁細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增傳代。

使用骨組織消化法分離BMSCs也并非*有效，II型膠原酶的消化可能影響B(tài)MSCs活性及增殖能力。