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細(xì)胞冷凍保存常識

2022-01-18 瀏覽次數(shù)：2252

1.1.欲冷凍保存的細(xì)胞應(yīng)在生長良好的指數(shù)生長期且高存活率，約為80-90%的匯合度。

1.2.冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如雜交瘤細(xì)胞應(yīng)在冷凍保存前一至二日測

試是否有抗體之產(chǎn)生。

1.3.注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色。4℃避光保存，勿作多次解凍。甘油亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲(chǔ)存后對細(xì)胞會(huì)有毒性。

1.4.冷凍保存之細(xì)胞濃度： DMSO 的濃度介于 5%~20% 之間。生長培養(yǎng)液的體積應(yīng)調(diào)整以適于所用細(xì)胞保護(hù)劑的變化。

1.4.1.正常人成纖維細(xì)胞:1-3×106 cells/ml

1.4.2.雜交瘤細(xì)胞:1-3x106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些雜交瘤細(xì)胞會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后si去。

1.4.3.貼壁的腫瘤細(xì)胞系:5-7x106cells/ml，依細(xì)胞種類而異。腺癌解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1-3×106cells/ml。

1.4.4.其他懸浮細(xì)胞:5-10× 106cells/ml,humanlymphocyte須至少5×106cells/ml。

1.5.冷凍保護(hù)劑濃度為5%或10%DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同

時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)對照培養(yǎng)，以防止冷凍失敗。+n6

2.細(xì)胞冷凍保存的具體操作

2.材料：

2.1.生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞

2.2.新鮮培養(yǎng)基

2.3.DMSO(SigmaD-2650)

2.4.無菌塑料冷凍保存管

2.5.0.4％ w/v臺盼藍(lán)

2.6.血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片

2.7.等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII)

3.步驟：

3.1.冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。

3.2.配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10％，

混合均勻，置于室溫下待用。

3.3.依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約20ul)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃

度及凍前存活率。

3.4.離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，對應(yīng)細(xì)胞適合的凍存密度混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1ml/管，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。

3.5.冷凍保存方法：在每一個(gè)凍存管上注明細(xì)胞系的名字，凍存者姓名和凍存時(shí)間，方便日后尋找。將一批細(xì)胞用橡皮筋捆綁住，用足夠多的棉花將凍存管包裹，包括燒杯的底座和瓶頂，保護(hù)細(xì)胞逐級冷卻，防止過快冷凍產(chǎn)生的冰晶破壞細(xì)胞狀態(tài)，放入-80℃冷凍，然后放置于液氮中。

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