蛋白質的表達、分離、純化實驗

基因重組—層析法
實驗方法原理
攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中，在 37℃，IPTG誘導下，超量表達攜帶有6個連續組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質加以提純，實為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。

實驗材料
大腸桿菌BL21
試劑、試劑盒
LB液體培養基 氨芐青霉素 Washing Buffer Elution Buffer IPTG 蒸餾水 胰蛋白胨 酵母粉 氯化鈉
儀器、耗材
搖床 離心機 層析柱 離心管 移液槍 槍頭盒 燒杯 玻璃棒

實驗步驟
一、試劑準備
1.  LB液體培養基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸餾水配至1000 mL。
2.  氨芐青霉素：100 mg/mL。
3.  上樣緩沖液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM  2-ME，pH8.0。
4.  Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5.   Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。
6.   IPTG：100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22 um濾膜抽濾，-20℃保存。

二、獲得目的基因
1.  通過PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環獲得所需基因片段。
2.  通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。

三、構建重組表達載體
1.  載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2.  PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

四、獲得含重組表達質粒的表達菌種
1.  將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，根據重組載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。
2.  測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3.  以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。

五、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的誘導
1.   接種含有重組氯霉素酰基轉移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5 mL LB液體培養基中（含100 ug/mL 氨芐青霉素），37℃震蕩培養過夜。
2.  按1∶50或1：100的比例稀釋過夜菌，一般轉接1 mL過夜培養物于100 mL（含100 ug/mL 氨芐青霉素）LB液體培養基中，37℃震蕩培養至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大約需3 h）。取10 ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。
3.   對照組不加誘導劑，實驗組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l，37℃繼續培養1-3h。
4.  12 000 rpm 離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。

六、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的分離、純化
1.  NTA層析柱的準備：在層析柱中加入1 mL NTA介質，并分別用8 mL 去離子水，8 mL上樣緩沖液洗滌。
2.  重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5 mL上樣緩沖液， 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min，4℃ 12000 rpm 離心 30 min，將上清吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。取10 ul 上清樣品用于SDS-PAGE 分析。
3.  上清樣品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
4.  洗脫雜蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01分步收集洗脫液，約3-4 h，取10 ul洗脫開始時的樣品用于SDS-PAGE 分析。
5.  洗脫目標蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 級分，分別取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
      
注意事項
1.  選擇表達載體時，要根據所表達蛋白的最終應用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達。
2.  融合表達時在選擇外源DNA同載體分子連接反應時，對轉錄和轉譯過程中密碼結構的閱讀不能發生干擾。
3.  菌液OD值要小于1，否則細胞太濃太老，不易破碎，且質粒易丟失。
4.  誘導時間最好做一個梯度，不同蛋白誘導時間需摸索。
5.  誘導溫度適當摸索：25、30℃。
6.  IPTG濃度：一般在1 mM 以內，可適當摸索。
7.  超聲條件可視實際情況改變，只要使菌體裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠。

其他
一、原核表達
1.  原核表達簡介
將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。

2.  大腸桿菌用于表達重組蛋白的特點
（1）易于生長和控制；
（2）用于細菌培養的材料不及哺乳動物細胞系統的材料昂貴；
（3）有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質粒可供選擇；
（4）在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象。

3.  原核表達載體
通常為質粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：
（1）選擇標志的編碼序列；
（2）可控轉錄的啟動子；
（3）轉錄調控序列(轉錄終止子，核糖體結合位點)；
（4）一個多限制酶切位點接頭；
（5）宿主體內自主復制的序列。

4.  原核表達一般程序
獲得目的基因－準備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉化表達宿主菌－誘導靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進一步檢測。